Cromatograffaeth hylif yw'r prif ddull ar gyfer profi cynnwys pob cydran ac amhureddau mewn deunyddiau crai, canolradd, paratoadau a deunyddiau pecynnu, ond nid oes gan lawer o sylweddau ddulliau safonol i ddibynnu arnynt, felly mae'n anochel datblygu dulliau newydd. Wrth ddatblygu dulliau cyfnod hylif, y golofn gromatograffig yw craidd cromatograffaeth hylif, felly mae sut i ddewis colofn gromatograffig addas yn hanfodol. Yn yr erthygl hon, bydd yr awdur yn esbonio sut i ddewis colofn cromatograffaeth hylif o dair agwedd: syniadau cyffredinol, ystyriaethau a chwmpas cymhwyso.
A.Syniadau cyffredinol ar gyfer dewis colofnau cromatograffaeth hylifol
1. Gwerthuswch briodweddau ffisegol a chemegol y dadansoddwr: megis strwythur cemegol, hydoddedd, sefydlogrwydd (fel a yw'n hawdd cael ei ocsideiddio / ei leihau / ei hydroleiddio), asidedd ac alcalinedd, ac ati, yn enwedig y strwythur cemegol yw'r allwedd ffactor wrth benderfynu ar yr eiddo, fel y grŵp cyfun wedi amsugno uwchfioled cryf a fflworoleuedd cryf;
2. Penderfynwch ar ddiben dadansoddi: a oes angen gwahaniad uchel, effeithlonrwydd colofn uchel, amser dadansoddi byr, sensitifrwydd uchel, ymwrthedd pwysedd uchel, bywyd colofn hir, cost isel, ac ati;
- Dewiswch golofn gromatograffig addas: deall cyfansoddiad, priodweddau ffisegol a chemegol y llenwad cromatograffig, megis maint y gronynnau, maint y mandwll, goddefgarwch tymheredd, goddefgarwch pH, arsugniad y dadansoddwr, ac ati.
- Ystyriaethau ar gyfer dewis colofnau cromatograffaeth hylifol
Bydd y bennod hon yn trafod y ffactorau i'w hystyried wrth ddewis colofn cromatograffaeth o safbwynt priodweddau ffisegol a chemegol y golofn cromatograffaeth ei hun. 2.1 Matrics llenwi
2.1.1 Matrics gel silica Matrics llenwi'r rhan fwyaf o golofnau cromatograffaeth hylif yw gel silica. Mae gan y math hwn o lenwi purdeb uchel, cost isel, cryfder mecanyddol uchel, ac mae'n hawdd addasu grwpiau (fel bondio ffenyl, bondio amino, bondio cyano, ac ati), ond mae'r gwerth pH a'r ystod tymheredd y mae'n eu goddef yn gyfyngedig: y ystod pH y mwyafrif o lenwwyr matrics gel silica yw 2 i 8, ond gall ystod pH y cyfnodau bondio gel silica a addaswyd yn arbennig fod mor eang â 1.5 i 10, ac mae yna hefyd gel silica wedi'i addasu'n arbennig cyfnodau bondio sy'n sefydlog ar pH isel, megis Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, sy'n sefydlog ar pH 1 i 8; mae terfyn tymheredd uchaf y matrics gel silica fel arfer yn 60 ℃, a gall rhai colofnau cromatograffaeth oddef tymheredd o 40 ℃ ar pH uchel.
2.1.2 Matrics polymer Mae llenwyr polymer yn bennaf yn bolystyren-divinylbensen neu polymethacrylate. Eu manteision yw y gallant oddef ystod pH eang - gellir eu defnyddio yn yr ystod o 1 i 14, ac maent yn fwy ymwrthol i dymheredd uchel (gall gyrraedd uwch na 80 ° C). O'i gymharu â llenwyr C18 sy'n seiliedig ar silica, mae gan y math hwn o lenwad hydroffobig cryfach, ac mae'r polymer macroporous yn effeithiol iawn wrth wahanu samplau fel proteinau. Ei anfanteision yw bod effeithlonrwydd y golofn yn is ac mae'r cryfder mecanyddol yn wannach na llenwyr sy'n seiliedig ar silica. 2.2 Siâp gronynnau
Mae'r rhan fwyaf o lenwwyr HPLC modern yn ronynnau sfferig, ond weithiau maent yn ronynnau afreolaidd. Gall gronynnau sfferig ddarparu pwysedd colofn is, effeithlonrwydd colofn uwch, sefydlogrwydd a bywyd hirach; wrth ddefnyddio cyfnodau symudol gludedd uchel (fel asid ffosfforig) neu pan fo'r hydoddiant sampl yn gludiog, mae gan ronynnau afreolaidd arwynebedd penodol mwy, sy'n fwy ffafriol i weithred lawn y ddau gam, ac mae'r pris yn gymharol isel. 2.3 Maint gronynnau
Y lleiaf yw maint y gronynnau, yr uchaf yw effeithlonrwydd y golofn a'r uchaf yw'r gwahaniad, ond y gwaethaf yw'r ymwrthedd pwysedd uchel. Y golofn a ddefnyddir amlaf yw'r golofn maint gronynnau 5 μm; os yw'r gofyniad gwahanu yn uchel, gellir dewis llenwad 1.5-3 μm, sy'n ffafriol i ddatrys problem gwahanu rhai matrics cymhleth a samplau aml-gydran. Gall UPLC ddefnyddio llenwyr 1.5 μm; Defnyddir llenwyr maint gronynnau 10 μm neu fwy yn aml ar gyfer colofnau lled-baratoadol neu baratoadol. 2.4 Cynnwys carbon
Mae cynnwys carbon yn cyfeirio at gyfran y cyfnod bondio ar wyneb gel silica, sy'n gysylltiedig ag arwynebedd penodol a sylw cyfnod bondio. Mae cynnwys carbon uchel yn darparu gallu colofn uchel a datrysiad uchel, ac fe'i defnyddir yn aml ar gyfer samplau cymhleth sy'n gofyn am wahaniad uchel, ond oherwydd yr amser rhyngweithio hir rhwng y ddau gam, mae'r amser dadansoddi yn hir; mae gan golofnau cromatograffig cynnwys carbon isel amser dadansoddi byrrach a gallant ddangos detholiadau gwahanol, ac fe'u defnyddir yn aml ar gyfer samplau syml sydd angen dadansoddiad cyflym a samplau sydd angen amodau cyfnod dyfrllyd uchel. Yn gyffredinol, mae cynnwys carbon C18 yn amrywio o 7% i 19%. 2.5 Maint mandwll ac arwynebedd penodol
Mae cyfryngau arsugniad HPLC yn ronynnau mandyllog, ac mae'r rhan fwyaf o ryngweithio'n digwydd yn y mandyllau. Felly, rhaid i foleciwlau fynd i mewn i'r mandyllau i gael eu harsugno a'u gwahanu.
Mae maint mandwll ac arwynebedd arwyneb penodol yn ddau gysyniad cyflenwol. Mae maint mandwll bach yn golygu arwynebedd arwyneb penodol mawr, ac i'r gwrthwyneb. Gall arwynebedd arwyneb penodol mawr gynyddu'r rhyngweithio rhwng moleciwlau sampl a chyfnodau bondio, gwella cadw, cynyddu llwyth sampl a chynhwysedd colofn, a gwahanu cydrannau cymhleth. Mae llenwyr mandyllog llawn yn perthyn i'r math hwn o lenwwyr. Ar gyfer y rhai sydd â gofynion gwahanu uchel, argymhellir dewis llenwyr ag arwynebedd penodol mawr; gall arwynebedd bach penodol leihau pwysau cefn, gwella effeithlonrwydd colofn, a lleihau amser ecwilibriwm, sy'n addas ar gyfer dadansoddi graddiant. Mae llenwyr cregyn craidd yn perthyn i'r math hwn o lenwwyr. Ar y rhagosodiad o sicrhau gwahaniad, argymhellir dewis llenwyr ag arwynebedd penodol bach ar gyfer y rhai sydd â gofynion effeithlonrwydd dadansoddi uchel. 2.6 Cyfaint mandwll a chryfder mecanyddol
Mae cyfaint mandwll, a elwir hefyd yn “gyfaint mandwll”, yn cyfeirio at faint y cyfaint gwag fesul uned gronyn. Gall adlewyrchu cryfder mecanyddol y llenwad yn dda. Mae cryfder mecanyddol llenwyr â chyfaint mandwll mawr ychydig yn wannach na chryfder llenwyr â chyfaint mandwll bach. Defnyddir llenwyr â chyfaint mandwll sy'n llai na neu'n hafal i 1.5 mL/g yn bennaf ar gyfer gwahanu HPLC, tra bod llenwyr â chyfaint mandwll yn fwy na 1.5 mL/g yn cael eu defnyddio'n bennaf ar gyfer cromatograffaeth allgáu moleciwlaidd a chromatograffaeth pwysedd isel. 2.7 Cyfradd gapio
Gall capio leihau'r brigau cynffonnau a achosir gan y rhyngweithio rhwng cyfansoddion a grwpiau silanol agored (fel bondio ïonig rhwng cyfansoddion alcalïaidd a grwpiau silanol, grymoedd van der Waals a bondiau hydrogen rhwng cyfansoddion asidig a grwpiau silanol), a thrwy hynny wella effeithlonrwydd colofn a siâp brig . Bydd cyfnodau bondio heb eu capio yn cynhyrchu gwahanol ddetholiadau o gymharu â chyfnodau bondio wedi'u capio, yn enwedig ar gyfer samplau pegynol.
- Cwmpas cymhwysiad gwahanol golofnau cromatograffaeth hylif
Bydd y bennod hon yn disgrifio cwmpas cymhwyso gwahanol fathau o golofnau cromatograffaeth hylif trwy rai achosion.
3.1 Colofn gromatograffig cam C18 wedi'i wrthdroi
Colofn C18 yw'r golofn cam wrthdroi a ddefnyddir amlaf, a all fodloni profion cynnwys ac amhuredd y rhan fwyaf o sylweddau organig, ac mae'n berthnasol i sylweddau pegynol canolig, pegynol gwan ac amhenodol. Dylid dewis math a manyleb colofn cromatograffig C18 yn unol â'r gofynion gwahanu penodol. Er enghraifft, ar gyfer sylweddau â gofynion gwahanu uchel, defnyddir manylebau 5 μm * 4.6 mm * 250 mm yn aml; ar gyfer sylweddau â matricsau gwahanu cymhleth a pholaredd tebyg, gellir defnyddio manylebau 4 μm * 4.6 mm * 250 mm neu feintiau gronynnau llai. Er enghraifft, defnyddiodd yr awdur golofn 3 μm * 4.6 mm * 250 mm i ganfod dau amhuredd genotocsig mewn API celecoxib. Gall gwahaniad y ddau sylwedd gyrraedd 2.9, sy'n ardderchog. Yn ogystal, o dan y rhagosodiad o sicrhau gwahaniad, os oes angen dadansoddiad cyflym, dewisir colofn fer o 10 mm neu 15 mm yn aml. Er enghraifft, pan ddefnyddiodd yr awdur LC-MS/MS i ganfod amhuredd genotocsig mewn API ffosffad piperaquine, defnyddiwyd colofn 3 μm * 2.1 mm * 100 mm. Y gwahaniad rhwng yr amhuredd a'r brif gydran oedd 2.0, a gellir cwblhau canfod sampl mewn 5 munud. 3.2 Colofn ffenyl cyfnod gwrthdroi
Mae colofn ffenyl hefyd yn fath o golofn cyfnod gwrthdroi. Mae gan y math hwn o golofn ddetholusrwydd cryf ar gyfer cyfansoddion aromatig. Os yw ymateb cyfansoddion aromatig a fesurir gan golofn C18 arferol yn wan, gallwch ystyried ailosod y golofn ffenyl. Er enghraifft, pan oeddwn yn gwneud API celecoxib, roedd ymateb y prif gydran a fesurwyd gan golofn ffenyl yr un gwneuthurwr a'r un fanyleb (pob un yn 5 μm * 4.6 mm * 250 mm) tua 7 gwaith yn fwy na'r golofn C18. 3.3 Colofn cyfnod arferol
Fel atodiad effeithiol i golofn cyfnod gwrthdroi, mae colofn cyfnod arferol yn addas ar gyfer cyfansoddion pegynol iawn. Os yw'r brig yn dal i fod yn gyflym iawn wrth eluting gyda mwy na 90% cyfnod dyfrllyd yn y golofn cyfnod gwrthdroi, a hyd yn oed yn agos at ac yn gorgyffwrdd ag uchafbwynt y toddydd, gallwch ystyried ailosod y golofn cyfnod arferol. Mae'r math hwn o golofn yn cynnwys colofn hilic, colofn amino, colofn cyano, ac ati.
3.3.1 Colofn hilic Mae colofn hilic fel arfer yn ymgorffori grwpiau hydroffilig yn y gadwyn alcyl bondio i wella'r ymateb i sylweddau pegynol. Mae'r math hwn o golofn yn addas ar gyfer dadansoddi sylweddau siwgr. Defnyddiodd yr awdur y math hwn o golofn wrth wneud cynnwys a sylweddau cysylltiedig xylose a'i ddeilliadau. Gall isomerau deilliad xylose hefyd gael eu gwahanu'n dda;
3.3.2 Colofn amino a cholofn cyano Mae colofn amino a cholofn cyano yn cyfeirio at gyflwyno addasiadau amino a cyano ar ddiwedd y gadwyn alcyl bondio, yn y drefn honno, i wella'r detholiad ar gyfer sylweddau arbennig: er enghraifft, mae colofn amino yn ddewis da ar gyfer gwahanu siwgrau, asidau amino, basau ac amidau; mae gan golofn cyano ddetholusrwydd gwell wrth wahanu sylweddau strwythurol tebyg hydrogenedig ac anhydrogenedig oherwydd presenoldeb bondiau cyfun. Yn aml, gellir newid colofn amino a cholofn cyano rhwng colofn cyfnod arferol a cholofn cam cefn, ond ni argymhellir newid aml. 3.4 Colofn Chiral
Mae colofn cirol, fel y mae'r enw'n ei awgrymu, yn addas ar gyfer gwahanu a dadansoddi cyfansoddion cirol, yn enwedig ym maes fferyllol. Gellir ystyried y math hwn o golofn pan na all cyfnod gwrthdroi confensiynol a cholofnau cyfnod arferol gyflawni gwahaniad isomerau. Er enghraifft, defnyddiodd yr awdur golofn gorol 5 μm * 4.6 mm * 250 mm i wahanu'r ddau isomer o 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S) -1, 2-diphenylethylenediamine a (1R, 2R) -1, 2 -diphenylethylenediamine, a chyrhaeddodd y gwahaniad rhwng y ddau tua 2.0. Fodd bynnag, mae colofnau cirol yn ddrytach na mathau eraill o golofnau, fel arfer 1W +/darn. Os oes angen colofnau o'r fath, mae angen i'r uned wneud cyllideb ddigonol. 3.5 Colofn cyfnewid Ion
Mae colofnau cyfnewid ïon yn addas ar gyfer gwahanu a dadansoddi ïonau â gwefr, megis ïonau, proteinau, asidau niwclëig, a rhai sylweddau siwgr. Yn ôl y math o lenwad, fe'u rhennir yn golofnau cyfnewid cation, colofnau cyfnewid anion, a cholofnau cyfnewid cation cryf.
Mae colofnau cyfnewid cation yn cynnwys colofnau sy'n seiliedig ar galsiwm a hydrogen, sy'n addas yn bennaf ar gyfer dadansoddi sylweddau cationig megis asidau amino. Er enghraifft, defnyddiodd yr awdur golofnau calsiwm wrth ddadansoddi calsiwm gluconate a chalsiwm asetad mewn hydoddiant fflysio. Roedd gan y ddau sylwedd ymatebion cryf ar λ = 210nm, a chyrhaeddodd y radd wahanu 3.0; defnyddiodd yr awdur golofnau hydrogen wrth ddadansoddi sylweddau cysylltiedig â glwcos. Roedd gan nifer o sylweddau cysylltiedig mawr - maltos, maltotriose a ffrwctos - sensitifrwydd uchel o dan synwyryddion gwahaniaethol, gyda therfyn canfod mor isel â 0.5 ppm a gradd gwahanu o 2.0-2.5.
Mae colofnau cyfnewid anion yn bennaf addas ar gyfer dadansoddi sylweddau anionig megis asidau organig ac ïonau halogen; mae gan golofnau cyfnewid cation cryf allu cyfnewid ïon uwch a detholusrwydd, ac maent yn addas ar gyfer gwahanu a dadansoddi samplau cymhleth.
Dim ond cyflwyniad yw'r uchod i fathau ac ystodau cymwysiadau nifer o golofnau cromatograffaeth hylif cyffredin ynghyd â phrofiad yr awdur ei hun. Mae yna fathau arbennig eraill o golofnau cromatograffig mewn cymwysiadau gwirioneddol, megis colofnau cromatograffig mandwll mawr, colofnau cromatograffig mandwll bach, colofnau cromatograffaeth affinedd, colofnau cromatograffig amlfodd, colofnau cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-uchel (UHPLC), colofnau cromatograffaeth hylif uwch-gritigol ( SFC), ac ati Maent yn chwarae rhan bwysig mewn gwahanol feysydd. Dylid dewis y math penodol o golofn cromatograffig yn ôl strwythur a phriodweddau'r sampl, gofynion gwahanu a dibenion eraill.
Amser postio: Mehefin-14-2024